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            基于成像毛細管等電聚焦(iCIEF)的餾分收集和在線質譜聯用技術用于表征治療性抗體的電荷異質性

            關鍵詞:iCIEF-MS
            時間:2023-03-29 10:09:08

              近期,在Analytical Methods上發表的一篇文章,介紹了基于成像毛細管等電聚焦(iCIEF)的餾分收集和在線質譜聯用的分析平臺來表征抗體電荷異質性??贵w的電荷變異體經過iCIEF分離后:1)通過MS直接檢測分子量;2)通過組分收集的方式獲取異構體的純組分,并用HPLC-MS分析其完整分子量。研究發現,由于iCIEF-MS的檢測靈敏度高于HPLC-MS,因此能在mAb的電荷變異體分析中,iCIEF-MS能觀察到HPLC-MS無法檢測到的一些低豐度的糖型。這是因為iCIEF-MS中使用的流速(小于5 μL/min)遠低于HPLC-MS中使用的流量(300 μL/min),較低的流速導致在ESI離子化時產生更高的溶劑蒸發效率和質譜效率。此外,iCIEF分離時的聚焦預濃縮也有助于提高靈敏度。

              本文將對文章的部分內容進行介紹,如有感興趣的讀者,可閱讀原文章以獲取更多內容。

              原文見:Anal. Methods, 2023, 15, 411

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              抗體的電荷異質性可能由于翻譯后修飾(PTMs)、降解反應(如脫酰胺、C-末端賴氨酸加工和糖基化)而產生。電荷變異體的存在可能會導致產品功效和藥代動力學改變、產品完全失活,或在最壞情況下增強免疫原性。

              生物技術行業中最常見的電荷變異體檢測方法包括離子交換色譜法(IEX)、傳統等電聚焦法(IEF)和成像毛細管等電聚焦(iCIEF)?;诘入婞c(pI)分離的iCIEF技術正成為整個制藥行業中蛋白質電荷異質性表征的金標準。此外,后續的質譜(MS)分析將為電荷變異體及其結構提供有力和全面的分析。盡管為此目的使用了不同的色譜-質譜聯用技術,但大多數技術都不能準確區分具有微小等電點(pI)差異的蛋白質異構體。毛細管電泳(CE)與質譜聯用一直被認為是生物制藥的一種有效的分析策略,包括毛細管區帶電泳法、cIEF和微流控毛細管電泳作為分離前端。具體而言,iCIEF和cIEF的快速、高分離分辨率與MS的分子量鑒定相結合,將為電荷異質性提供深度的分析。最近,iCIEF或cIEF已被證明是質譜檢測時的一種強大的前端分離工具,但仍需要改進以應對更高靈敏度、更高通量和更人性化操作方面的挑戰。

              至于蛋白質電荷變異體的制備,傳統的離線餾分收集技術,如等電聚焦(IEF)和自由流電泳(FFE),對于電荷變異體的制備來說,是一個更加繁瑣的過程。此外,傳統平板凝膠IEF方法收集的電荷變異體的數量和純度通常不足以進行進一步表征。目前,IEX已經被用于蛋白質電荷變異體的餾分收集。盡管IEX和IEF都是基于電荷的蛋白質分離方法,但它們依賴于不同的分離原理,因此,蛋白質電荷變異體之間可能沒有很好的相關性。由于IEX提供的分離分辨率較低,IEX餾分的純度和鹽含量通常不令人滿意。在傳統的毛細管電泳(CE)儀器上,傳統CIEF樣品區帶的分離和收集是不實用的,并且在商業上是不可用的。因此,iCIEF分析、iCIEF-MS串聯技術、制備iCIEF的餾分收集的集成平臺成為一種非常理想的方法,可以增強蛋白質藥物的電荷變異體表征能力。

              在本研究中,使用了加拿大AES公司開發的一種集成的iCIEF平臺,對一種治療性單克隆抗體的電荷變異體進行表征。使用iCIEF分析模式對抗體的主成分及其四種電荷變異體進行了分析,并當完成蛋白質在分離毛細管內的聚焦后,以制備模式對兩種主要的酸性和堿性電荷變異體進行餾分收集。收集的電荷變異體餾分在完整蛋白質水平上通過LC-MS進行表征,LC-MS的表征結果與使用iCIEF-MS表征的結果一致。該平臺集成的三種iCIEF操作模式的可以通過更換定制的毛細管分離柱進行快速靈活地切換。蛋白質異構體表征的整體研究策略是追求分析方法的簡便性、可靠性、準確性,而這種集成的分析平臺將為生物制藥行業的蛋白質異構體表征提供了全面的解決方案。

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            CEInfinite iCIEF分析兼制備型全柱成像毛細管電泳系統

              iCIEF制備與iCIEF-MS

              AES 公司的iCIEF制備技術可以實現高純度、多異構體、帶電蛋白質產物的分離、制備和收集,如圖1A所示。蛋白質聚焦完成后,用低濃度酸溶液作為遷移溶劑,以100–160 nL/min的流速從注射泵中流出,將聚焦的蛋白質區帶從分離毛細管中依次推出,觀察到的變異體峰被餾分收集,整個遷移過程中需保持高電壓。

              iCIEF-MS系統采用了與餾分收集相同的壓力遷移技術,如圖1B所示,iCIEF與MS的連接不需要對離子源進行特殊修改,并且可以直接連接到來自不同質譜品牌的質譜儀離子源。在iCIEF分離過程中,使用的獨特涂層的毛細管,使得iCIEF過程不需要添加聚合物MC和尿素。在50 nL/min流速下的0.1%甲酸遷移溶液和鞘液(水:乙腈=1:1 v/v,含有0.5%v/v甲酸)的作用下,毛細管中聚焦后的蛋白質區帶被無縫地引入MS離子源。

              iCIEF中的餾分收集和在線MS分析模式可以快速靈活地切換,只需更換定制的毛細管即可實現,而無需改變儀器配置。

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            圖1:(A)iCIEF制備收集和(B)在線iCIEF-MS的原理

              iCIEF-UV 分析mAb

              如圖2所示,在iCEIF-UV中使用100μm ID FC涂層毛細管很好地分離了mAb的主成分、酸性變異體(A1–A2)和堿性變異體(B1–B2)。整個iCIEF分析時間不到10分鐘。表1中給出了基于蛋白質組分的峰面積和pI的物質百分比。蛋白質主成分和四種電荷變異體的pI在6.5–8.5 pH范圍內,峰面積的重復性在RSD 5.0%以下(n=6)。觀察到痕量的酸性峰A1和堿性峰B2,其百分比分別為5.4%和2%。酸性A2和堿性B1是主要的電荷變異體,其百分比分別為16.7%和21.0%。

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            圖2:單克隆抗體的iCIEF-UV分析譜圖

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            表1 iCIEF分析mAb的電荷變異體的pIs和相對峰面積

              iCIEF制備用于mAb主成分和電荷變異體的餾分收集

              在制備型iCIEF上使用320 μm ID的AD涂層毛細管柱用于分離mAb的主成分和兩種電荷變異體(酸性A2和堿性B1),然后通過HPLC-MS進行完整蛋白質分析。如圖3所示,所有預期的蛋白質電荷變異體的峰首先通過施加高電壓沿著分離毛細管聚焦,然后由納升注射泵將聚焦的蛋白區帶遷移到轉移毛細管中,用于組分收集。收集過程是自動化的,通過連續運行制備,能在三天內分離出50-100 mg蛋白質。如圖3(左)所示,由納升注射泵驅動的遷移過程允許蛋白質的聚焦區帶移出分離毛細管,用于餾分收集。在遷移過程中,施加高電壓以保持分離分辨率。圖4證明了iCIEF制備對三個餾分的優異重復性,這足以確保通過多次制備獲得足夠多的高純度蛋白電荷變異體組分。使用iCIEF-UV對收集餾分再次分析,結果表明三個餾分中每個峰的純度都在70.0%以上,收集量在50 mg以上,相應的回收率在20-40%之間。在餾分收集之后,對三個收集的餾分進行HPLC-MS分析以進行完整分子量的鑒定(圖6A)。隨后可以通過LC-MS/MS的深度肽圖譜表征來進行電荷修飾的鑒定,該研究正在進行中。

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            圖3 iCIEF制備收集中的電荷變異體蛋白區帶遷移過程

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            圖4 主成分及其兩種主要電荷變異體的組分收集的重復性(n=6)

              iCIEF-MS分析mAb

              iCIEF-MS系統它允許mAb樣品在完整蛋白水平上快速篩選鑒定電荷變異體,且不需要進行餾分收集。iCIEF-MS使分離的蛋白質電荷變異體能夠直接注射到高靈敏度MS中,從而保留了前端iCIEF的優異分離分辨率。而與MS接口的無縫連接是基于微流,低流速又能幫助提高質譜檢測蛋白質的靈敏度。

              如圖6B所示,使用窄pH范圍的兩性電解質(pH 7-8)和200 μm ID MC涂層毛細管,在45分鐘內通過iCIEF-MS成功表征了mAb的主成分和四種電荷變異體(兩種酸性和兩種堿性變異體),同時通過全柱成像檢測記錄了其在質譜檢測前的iCIEF-UV圖譜。由于采用了新型的MC涂層分離毛細管,這種iCIEF-MS在線聯用策略避免了在樣品緩沖液中使用MC溶液作為添加劑。本研究中建立的iCIEF-MS比報道的單點檢測的cIEF-MS結果顯示出更高的通量,單點檢測分析時間超過1小時。此外,iCIEF-MS通過避免常規cIEF-MS所使用的繁瑣的化學遷移,大大提高了可重復性。我們的研究表明,本研究中的iCIEF-MS靈敏度優異,尤其是對微量的變異體A1和B2,如圖6B所示。

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            圖6:(A)HPLC-MS和(B)iCIEF-MS分析mAb電荷變異體

              iCIEF-MS與HPLC-MS分析mAb完整分子量的比較

              主成分和兩種電荷變異體(酸性A2和堿性B1)的MW鑒定利用收集組分的LC-MS分析和在線iCIEF-MS表征進行了比較(圖7)。在iCIEF-MS的質譜中觀察到了mAb的一些低豐度的糖型,但使用HLPC-MS方法沒有檢測到這些糖基化類型。這體現了iCIEF-MS的靈敏度要高于HPLC-MS,因為iCIEF-MS中所使用的流速(小于5 μL/min)遠低于HPLC-MS中使用的流速(300 μL/min)。較低的流速導致更高的溶劑蒸發效率和質譜效率。此外,iCIEF分離中的聚焦預濃縮也有助于提高靈敏度。這項研究表明,該iCIEF-MS平臺可以進行極其快速的指紋識別,并為可能識別靶向電荷變異體提供初步說明。收集餾分的LC-MS分析有助于在完整和肽圖水平上進行深入表征。

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            圖7:通過HPLC-MS對收集的餾分和在線iCIEF-MS對電荷變異體(A)主成分(B)酸性A2(C)堿性B1進行表征

              這是首次在一臺儀器上提供集成iCIEF-UV、餾分收集和iCIEF-MS聯用的分析平臺。以前,由于iCIEF中的蛋白質峰不能被收集或MS在線檢測,當iCIEF分離完成時,必須使用傳統的IEX、IEF和FFE來制備觀察到的蛋白質電荷變異體。然而,由于IEX、IEF和FFE與iCIEF技術的分離機制和分辨率不同,所收集的餾分通常不能很好地與iCIEF的結果相匹配,并且由于長時間的操作過程和使用了較強烈的化學試劑,蛋白在餾分收集過程中往往會發生變性。而在本研究的中建立的制備iCIEF很好地解決了蛋白質電荷變異體制備中的這一挑戰。

              參考文獻:略

              原文請參考:Teresa Kwok, Mike Zhou, Anna Schaefer. Fractionation and online mass spectrometry based on imaged capillary isoelectric focusing (icIEF) for characterizing charge heterogeneity of therapeutic antibody. Anal. Methods,2023,15,411

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